뢴트겐은 독일의 레네프에서 독일인 아버지와 네덜란드인 어머니 사이에서 태어났다. 어려서 그는 네덜란드에서 공부를 했는데, 그곳에서 학업을 마치지 못하고 1865년 입학 시험을 통해서 취리히의 연방 공과 대학 기계 공학과에 입학하였다. 그곳에서 박사 학위를 마친 그는 독일에서 과학자로서의 경력을 쌓기 시작하였다,. 대학에서 물리학을 가르치던 뢴트겐은 탄성, 유체의 모세관 작용, 기체의 비열, 결정 안에서의 열전도, 기체의 의한 열 흡수, 압전기 등을 연구하였다.

1895년 11월 8일 저녁, 뢴트겐은 암실에서 음극선관을 두꺼운 검은 마분지로 싸서 어떤 빛도 새어나올 수 없도록 하였다. 그런데 진공관(음극선관)에 전류를 흐르게 하는 실험을 했을 때 우연히 근처에 있는 나무 조각에서 빛이 나오는 것을 관찰하였다. 그곳에는 백금시안화바륨을 바른 스크린이 놓여 있었다. 음극선관을 검은 종이로 감쌌기 때문에 음극선이 새나갈 이유는 없었다. 뢴트겐은 음극선관에서 형광을 띠는 새로운 종류의 ‘선(ray)’이 나왔다는 사실에 주목하였다.

뢴트겐은 음극선과 스크린 사이에 검은 마분지 대신 나무판자, 헝겊, 금속판 등을 바꿔가며 실험을 반복하였다. 그 결과 이 새로운 복사선이 여러 물질 중에서 종이, 나무, 알루미늄 등을 쉽게 통과한다는 것과 사진 건판에 영향을 준다는 것을 밝혀냈다. ‘미지의 빛’이라는 뜻에서 이 새로운 광선을 ‘X-선’이라 명명한 뢴트겐은 이 사실을 아무에게도 알리지 않고 실험을 계속하였다. 12월 22일, 자신의 아내의 왼손을 감광판 위에 놓고 실험한 결과 살아있는 사람의 뼈가 사진으로 찍혀 나왔다

사진은 이듬해 학회지에 제출한 그의 논문 ‘새로운 광선에 대해서’와 함께 그에게 세계적인 명성을 안겨주었다. 이후 X선은 많은 학자들의 연구에 의해 인간에게 여러 가지로 유익하게 쓸 수 있는 도구가 되었다. 뢴트겐은 X선의 발견으로 1901년 최초의 노벨물리학상을 수상하였다. 그의 'X선' 발견은 의학에서 병의 진단, 물리학, 화학, 광물학 등에서도 널리 쓰이고 있다.